在日常細胞實驗檢測中,這些常規(guī)細胞實驗一定要知道!
細胞增殖實驗
1.MTT法:
是一種檢測細胞存活和生長的方法。該方法已廣泛用于生物活性因子的活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟、快捷。原理:活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚,用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光度值,可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內,MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。
2.CCK-8法:
可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析,常用于藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗。
原理:該試劑中含有WST-8【化學名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】,它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-MethoxyPMS)的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物(Formazandye)。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。
3.Brdu:
即5-Bromo-2'-Deoxyuridine,中文全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷,為胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期,S期活體注射或細胞培養(yǎng)加入。而后利用抗Brdu單克隆抗體ICC染色顯示增殖細胞。同時結合其它細胞標記物雙重染色可判斷增殖細胞的種類,增殖速度,對研究細胞動力學有重要意義。但由于抗體分子量大,難于摻入并被有效檢測。因此BrdU檢測需采用DNA酶或HCl或加熱使DNA變性。這些處理方法會破壞抗原識別位點,此外許多細胞周期分析的染料都需要dsDNA這種處理方法也使得同一樣本無法同時進行細胞周期分析。對于植物細胞等有細胞壁的分析。采用抗體檢測還需要消化細胞壁,細胞壁消化酶常含有一些雜質,會導致檢測的可靠性降低,同時BrdU檢測則需要進行長時間的孵育--幾個小時甚至過夜。
4.EDU:
即5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,是一種胸腺嘧啶核苷類似物,能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復制的DNA分子中。通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應快速檢測細胞DNA復制活性,適用于細胞增殖、細胞分化、生長與發(fā)育、DNA修復、病毒復制、細胞標記示蹤等方面的研究,尤其適合進行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他藥物的篩選實驗。
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