類器官的培養可以利用體細胞、成體干細胞（包括祖細胞）或多能干細胞。2009年，腸道器官模擬技術率先取得突破，研究人員發現，成人腸道干細胞可以在體外增殖和自發組織化。其特征是能夠表達LGR5，這是一種編碼Wnt激動劑R-spondin受體的基因，同時需要特定的分子圍繞在旁（如Wnt、KGF和noggin）。以此為理論基礎，研究人員開發了一種三維培養體系，能夠在體外重建腸道干細胞的適宜環境，并從腸道上皮細胞或單個LGR5+干細胞分化出具有自我更新能力、保持腸道腺窩絨毛狀結構的類器官。該模型可以持續擴增達3個月，穩定的基因組保證了純化和生產放大等優勢，此后這種方法被用于從其它主要器官上皮組織培養各種類器官。

成人干細胞衍生的類器官培養，通常是通過將分離的成人干細胞或所需器官培養的單細胞懸浮液，嵌入到細胞外基質（ECM）水凝膠中來建立的。例如腸道器官，從小腸或結腸分離出的隱窩細胞足以培養出類器官，也可以從分離的成人腸干細胞中培養出類器官。

上皮類器官培養基是以附加與器官相關的生長因子的培養基為基礎的。因此，從其他組織（如呼吸道、肝臟、胰腺、皮膚、膀胱、大腦、心臟）提取的細胞器要求在培養中補充相關生長因子。例如大腦類器官培養過程如下圖：誘導多能干細胞（iPSC）衍生細胞在神經誘導介質中生長，產生神經外胚層，嵌入Matrigel中，并在旋轉生物反應器或軌道搖床中生長，以更好地擴散，獲得三維腦器官。在暴露于維甲酸的情況下，大腦器官通過自我組裝模式，形成自締和組織，形成包括放射狀膠質細胞在內的不同種群的神經祖細胞，這些神經祖細胞擴展形成大腦結構。

除了成體干細胞，多能干細胞（包括誘導干細胞和胚胎干細胞）也可以利用其自我更新及分化能力來制備類器官。由于從多能干細胞中提取的類器官是通過 同質群體定向分化而形成的，因此，必須在一個喚醒胚胎發生的動態過程中重新創造組織特異性細胞類型及其微環境。因此，多能干細胞類器官培養必須在分化過程中提供合適的生態位信號。由于這一過程較復雜，多能干細胞類器官往往含有不同于模型器官的細胞類型，使靶組織的信號環境和自組織復雜化。

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